Masse moléculaire
La masse moléculaire d'un peptide est la somme des masses atomiques de tous les atomes qui le composent, après formation des liaisons peptidiques (chaque liaison amide implique la perte d'une molécule d'eau par condensation). C'est un paramètre d'identité fondamental : deux peptides de même séquence ont la même masse moléculaire, et toute déviation par rapport à la valeur théorique calculée signale une erreur de séquence, une modification chimique ou une impureté.
Les unités usuelles sont le dalton (Da) et le kilodalton (kDa, 1 kDa = 1000 Da). Historiquement définie comme 1/12 de la masse d'un atome de ¹²C, la définition récente (2019, nouvel SI) fixe la constante de masse atomique à mu = 1,66053906660(50) × 10⁻²⁷ kg. Un peptide de 10 résidus pèse typiquement 1-1,5 kDa ; une hormone peptidique comme l'insuline pèse 5,8 kDa ; un anticorps monoclonal tourne autour de 150 kDa.
Deux notions de masse coexistent et il est crucial de ne pas les confondre. La masse monoisotopique somme les masses exactes des isotopes les plus abondants de chaque élément (¹H = 1,00783 Da, ¹²C = 12,00000, ¹⁴N = 14,00307, ¹⁶O = 15,99491, ³²S = 31,97207). Elle correspond au pic le plus intense dans un spectre MS haute résolution d'une petite molécule ou d'un peptide court. La masse moyenne tient compte de la distribution isotopique naturelle pondérée par l'abondance (C = 12,011, N = 14,007, etc.). Elle est plus pertinente pour les grandes protéines où le pic monoisotopique devient indétectable au profit d'une distribution large. La différence entre les deux s'accroît avec la masse : négligeable pour un dipeptide (< 0,01 Da), significative pour une protéine de 50 kDa (plusieurs Da).
Les méthodes de mesure de la masse moléculaire sont dominées par la spectrométrie de masse. MALDI-TOF pour les peptides mono-chargés jusqu'à 20 kDa (précision 5-50 ppm), ESI-QTOF ou ESI-Orbitrap pour les peptides et protéines multi-chargés (précision 1-10 ppm). L'analyse en mode MS simple donne la masse native ; l'analyse en MS/MS avec fragmentation (CID, HCD, ETD) confirme la séquence par analyse des ions fragments b et y. Historiquement, l'analyse par gel d'électrophorèse SDS-PAGE et la chromatographie d'exclusion stérique estimaient la masse à 10-20 % près, précision très insuffisante pour le contrôle qualité moderne.
La vérification d'identité peptidique sur un certificat d'analyse se lit comme suit : masse théorique calculée à partir de la séquence (par exemple 1420,62 Da monoisotopique pour un peptide donné), masse observée par MS (par exemple 1420,615 Da), différence en ppm (≈ 4 ppm ici), acceptation si < 10 ppm en pratique. Une différence plus grande signale une erreur de séquence, une modification non intentionnelle (oxydation +16 Da, désamidation +1 Da, acétylation +42 Da) ou une impureté majeure coéluant avec le produit.