Masa molecular
La masa molecular de un péptido es la suma de las masas atómicas de todos los átomos que lo constituyen tras la formación del enlace peptídico (cada enlace amida implica la pérdida de una molécula de agua por condensación). Es un parámetro de identidad fundamental: dos péptidos de la misma secuencia tienen la misma masa molecular, y cualquier desviación respecto al valor teórico calculado indica un error de secuencia, una modificación química o una impureza.
Las unidades habituales son el dalton (Da) y el kilodalton (kDa, 1 kDa = 1000 Da). Definido históricamente como 1/12 de la masa de un átomo de ¹²C, la definición reciente (2019, nuevo SI) fija la constante de masa atómica en mu = 1.66053906660(50) × 10⁻²⁷ kg. Un péptido de 10 residuos pesa típicamente 1-1.5 kDa; una hormona peptídica como la insulina pesa 5.8 kDa; un anticuerpo monoclonal ronda los 150 kDa.
Coexisten dos nociones de masa que no deben confundirse. La masa monoisotópica suma las masas exactas de los isótopos más abundantes de cada elemento (¹H = 1.00783 Da, ¹²C = 12.00000, ¹⁴N = 14.00307, ¹⁶O = 15.99491, ³²S = 31.97207). Corresponde al pico más intenso en un espectro de MS de alta resolución de una molécula pequeña o un péptido corto. La masa media tiene en cuenta la distribución isotópica natural ponderada por la abundancia (C = 12.011, N = 14.007, etc.). Es más relevante para proteínas grandes, donde el pico monoisotópico se vuelve indetectable en favor de una distribución amplia. La diferencia entre ambas crece con la masa: insignificante para un dipéptido (< 0.01 Da), significativa para una proteína de 50 kDa (varios Da).
Los métodos de medición de la masa molecular están dominados por la espectrometría de masas. MALDI-TOF para péptidos con carga única de hasta 20 kDa (precisión de 5-50 ppm), ESI-QTOF o ESI-Orbitrap para péptidos y proteínas con carga múltiple (precisión de 1-10 ppm). El modo MS simple da la masa nativa; la MS/MS con fragmentación (CID, HCD, ETD) confirma la secuencia analizando los iones fragmento b e y. Históricamente, la electroforesis en gel SDS-PAGE y la cromatografía de exclusión por tamaño estimaban la masa con un margen del 10-20%, una precisión ampliamente insuficiente para el control de calidad moderno.
La verificación de la identidad de un péptido en un certificado de análisis se lee así: masa teórica calculada a partir de la secuencia (por ejemplo, 1420.62 Da monoisotópica para un péptido dado), masa observada por MS (por ejemplo, 1420.615 Da), diferencia en ppm (≈ 4 ppm aquí), aceptación si < 10 ppm en la práctica. Una diferencia mayor indica un error de secuencia, una modificación no deseada (oxidación +16 Da, desamidación +1 Da, acetilación +42 Da) o una impureza importante que coeluye con el producto.