Molekülmasse
Die Molekülmasse eines Peptids ist die Summe der Atommassen aller seiner Atome nach Bildung der Peptidbindungen (jede Amidbindung geht mit dem Verlust eines Wassermoleküls durch Kondensation einher). Sie ist ein grundlegender Identitätsparameter: Zwei Peptide mit derselben Sequenz haben dieselbe Molekülmasse, und jede Abweichung vom berechneten theoretischen Wert weist auf einen Sequenzfehler, eine chemische Modifikation oder eine Verunreinigung hin.
Gängige Einheiten sind das Dalton (Da) und das Kilodalton (kDa, 1 kDa = 1000 Da). Historisch als 1/12 der Masse eines ¹²C-Atoms definiert, legt die neuere Definition (2019, neues SI) die atomare Massenkonstante auf mu = 1.66053906660(50) × 10⁻²⁷ kg fest. Ein Peptid aus 10 Resten wiegt typischerweise 1-1.5 kDa; ein Peptidhormon wie Insulin wiegt 5.8 kDa; ein monoklonaler Antikörper liegt bei etwa 150 kDa.
Zwei Massenbegriffe existieren nebeneinander und dürfen nicht verwechselt werden. Die monoisotopische Masse summiert die exakten Massen der häufigsten Isotope jedes Elements (¹H = 1.00783 Da, ¹²C = 12.00000, ¹⁴N = 14.00307, ¹⁶O = 15.99491, ³²S = 31.97207). Sie entspricht dem intensivsten Peak im hochauflösenden MS-Spektrum eines kleinen Moleküls oder kurzen Peptids. Die mittlere Masse berücksichtigt die natürliche, nach Häufigkeit gewichtete Isotopenverteilung (C = 12.011, N = 14.007 usw.). Sie ist relevanter für große Proteine, bei denen der monoisotopische Peak zugunsten einer breiten Verteilung nicht mehr nachweisbar ist. Der Unterschied zwischen beiden wächst mit der Masse: vernachlässigbar bei einem Dipeptid (< 0.01 Da), deutlich bei einem Protein von 50 kDa (mehrere Da).
Die Methoden zur Messung der Molekülmasse werden von der Massenspektrometrie dominiert. MALDI-TOF für einfach geladene Peptide bis 20 kDa (Genauigkeit 5-50 ppm), ESI-QTOF oder ESI-Orbitrap für mehrfach geladene Peptide und Proteine (Genauigkeit 1-10 ppm). Der einfache MS-Modus liefert die native Masse; MS/MS mit Fragmentierung (CID, HCD, ETD) bestätigt die Sequenz durch Analyse der b- und y-Fragmentionen. Historisch schätzten SDS-PAGE-Gelelektrophorese und Größenausschlusschromatographie die Masse auf 10-20 % genau, eine für die moderne Qualitätskontrolle bei Weitem unzureichende Genauigkeit.
Die Überprüfung der Peptididentität auf einem Analysenzertifikat liest sich wie folgt: aus der Sequenz berechnete theoretische Masse (zum Beispiel 1420.62 Da monoisotopisch für ein bestimmtes Peptid), durch MS beobachtete Masse (zum Beispiel 1420.615 Da), Abweichung in ppm (hier ≈ 4 ppm), Annahme in der Praxis bei < 10 ppm. Eine größere Abweichung weist auf einen Sequenzfehler, eine unbeabsichtigte Modifikation (Oxidation +16 Da, Desamidierung +1 Da, Acetylierung +42 Da) oder eine wesentliche, mit dem Produkt koeluierende Verunreinigung hin.