ESI-MS (Electrospray Ionization)
L'ESI (Electrospray Ionization, ionisation par électronébulisation) est la seconde grande technique d'ionisation douce utilisée en spectrométrie de masse biomoléculaire, développée par John Fenn (prix Nobel 2002 partagé avec Tanaka). Elle s'impose comme méthode de référence quand on souhaite coupler l'ionisation à une chromatographie liquide et analyser des échantillons en flux continu.
Le principe : l'échantillon en solution (eau-méthanol ou eau-acétonitrile additionné de 0,1 % d'acide formique ou TFA) est infusé à faible débit (1-1000 μL/min) à travers un capillaire porté à haut potentiel (±2 à ±5 kV) par rapport à la contre-électrode. Le champ électrique forme un cône de Taylor à l'extrémité du capillaire, puis un nébulisat de fines gouttelettes chargées. Sous un flux de gaz séchant (azote) et un gradient thermique, les gouttelettes évaporent leur solvant, se divisent (fissions coulombiques) et libèrent finalement des ions moléculaires en phase gazeuse.
La particularité distinctive de l'ESI est sa capacité à générer des ions multi-chargés pour les peptides et protéines de taille significative. Un peptide de 5 kDa peut apparaître sous forme d'ions [M+3H]³⁺, [M+4H]⁴⁺, [M+5H]⁵⁺, etc. Ce multi-charging décale les pics à des valeurs m/z plus basses, compatibles avec la gamme de la plupart des analyseurs, et permet d'analyser des protéines de plusieurs dizaines de kDa sur des instruments classiques.
Le couplage LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry) est l'application phare. Un gradient acétonitrile/eau sépare les peptides d'un digest tryptique en phase inverse C18, et le flux passe directement dans la source ESI. La spectrométrie de masse haute résolution (Orbitrap, QTOF, FT-ICR) fournit alors masse exacte (précision 1-5 ppm) et fragmentation MS/MS pour identification de séquence.
L'analyse quantitative bénéficie de techniques comme la SRM/MRM (Selected/Multiple Reaction Monitoring) sur triple quadrupôle : paires ion précurseur-ion fragment spécifiques permettant quantification absolue au ng/mL dans des matrices biologiques complexes (plasma, urine, homogénat tissulaire). Les isotopes stables (²H, ¹³C, ¹⁵N) en étalons internes donnent une précision de 5-10 % acceptable en pharmacocinétique.
Les forces de l'ESI : couplage LC pour mélanges complexes, multi-charging pour grandes molécules, quantification robuste, compatible avec tous types d'analyseurs modernes. Les limites : sensibilité aux sels et détergents (< 50 mM NaCl généralement), nécessité d'un solvant volatil compatible, suppression ionique dans les matrices biologiques, spectres plus complexes à interpréter pour les novices qu'en MALDI.