ESI-MS (ionización por electrospray)
La ESI (ionización por electrospray) es la segunda gran técnica de ionización suave utilizada en la espectrometría de masas biomolecular, desarrollada por John Fenn (Premio Nobel de 2002, compartido con Tanaka). Se ha convertido en el método de referencia cuando se acopla la ionización a la cromatografía de líquidos y se analizan muestras en flujo continuo.
Principio: la muestra en solución (agua-metanol o agua-acetonitrilo con 0.1 % de ácido fórmico o TFA) se infunde a bajo caudal (1-1000 μL/min) a través de un capilar mantenido a un potencial elevado (±2 a ±5 kV) respecto al contraelectrodo. El campo eléctrico forma un cono de Taylor en la punta del capilar y, después, un spray nebulizado de finas gotas cargadas. Bajo un flujo de gas de secado (nitrógeno) y un gradiente térmico, las gotas evaporan el disolvente, se dividen (fisiones coulómbicas) y acaban liberando iones moleculares en fase gaseosa.
La característica distintiva de la ESI es su capacidad para generar iones multicargados a partir de péptidos y proteínas de tamaño considerable. Un péptido de 5 kDa puede aparecer como iones [M+3H]³⁺, [M+4H]⁴⁺, [M+5H]⁵⁺, etc. Esta multicarga desplaza los picos hacia valores de m/z más bajos, compatibles con el rango de la mayoría de los analizadores, y permite analizar proteínas de varias decenas de kDa en instrumentos clásicos.
El acoplamiento LC-MS (cromatografía de líquidos-espectrometría de masas) es la aplicación estrella. Un gradiente acetonitrilo/agua separa los péptidos de un digerido tríptico en fase inversa C18, y el flujo entra directamente en la fuente ESI. La espectrometría de masas de alta resolución (Orbitrap, QTOF, FT-ICR) proporciona entonces la masa exacta (precisión de 1-5 ppm) y la fragmentación MS/MS para identificar la secuencia.
El análisis cuantitativo se beneficia de técnicas como SRM/MRM (Selected/Multiple Reaction Monitoring) en triples cuadrupolos: pares específicos ion precursor-ion fragmento que permiten una cuantificación absoluta a nivel de ng/mL en matrices biológicas complejas (plasma, orina, homogeneizado tisular). Los patrones internos marcados con isótopos estables (²H, ¹³C, ¹⁵N) ofrecen una precisión del 5-10 %, aceptable en farmacocinética.
Puntos fuertes de la ESI: acoplamiento LC para mezclas complejas, multicarga para moléculas grandes, cuantificación robusta, compatibilidad con todos los tipos de analizadores modernos. Limitaciones: sensibilidad a las sales y los detergentes (< 50 mM de NaCl en general), necesidad de un disolvente volátil compatible, supresión iónica en matrices biológicas y espectros más complejos de interpretar para los principiantes que los de MALDI.