RP-HPLC

RP-HPLC (cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa) es la técnica analítica de referencia para la separación, la purificación y el control de pureza de los péptidos sintéticos. Se basa en la separación por hidrofobicidad, mediante una fase estacionaria apolar y una fase móvil polar — a la inversa de la cromatografía en fase normal, de ahí su nombre.

Principio y fase estacionaria. La columna de RP-HPLC es típicamente de sílice funcionalizada con cadenas alquílicas injertadas: C18 (octadecilo, la más universal para péptidos <5 kDa), C8 (octilo, péptidos moderadamente hidrófobos), C4 (butilo, péptidos y proteínas pequeñas de hasta 20 kDa), C3/C1 o fenilo (retención selectiva de aromáticos). Las dimensiones típicas son 250 × 4.6 mm en analítica, 250 × 21.2 mm en semipreparativa y 250 × 50 mm en preparativa. El tamaño de partícula (3, 5 o 10 μm) y la porosidad (100-300 Å) influyen en la resolución y la capacidad.

Fase móvil y gradiente. El gradiente estándar combina agua + 0.1% TFA (disolvente A, fase acuosa ácida) y acetonitrilo + 0.1% TFA (disolvente B, fase orgánica); el TFA actúa como agente de par iónico que neutraliza las cargas del péptido y mejora la simetría de los picos. Un gradiente típico del 10 al 70% de B en 20-40 min permite separar los péptidos lineales estándar. La detección UV a 214 nm (enlace peptídico) y 280 nm (Tyr, Trp) es universal; los detectores PDA, ELSD y MS (acoplamiento LC-MS) aportan información adicional.

Aplicaciones en péptidos. La RP-HPLC analítica valida la pureza de los lotes (≥98% en los péptidos RUO comerciales), identifica las impurezas (deleción, desamidación, oxidación, racemización) y permite su cuantificación relativa. La RP-HPLC preparativa es la etapa final crítica de la producción por SPPS para separar el péptido diana de las secuencias truncadas, los fragmentos aducto de TFA y las impurezas de síntesis. La técnica está documentada en las monografías USP <621> y Ph. Eur. 2.2.46 para los productos peptídicos farmacéuticos.