RP-HPLC (Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie) ist das analytische Referenzverfahren für die Trennung, Aufreinigung und Reinheitskontrolle synthetischer Peptide. Sie beruht auf einer Trennung nach Hydrophobie mit einer unpolaren stationären Phase und einer polaren mobilen Phase — umgekehrt zur Normalphasenchromatographie, daher der Name.
Prinzip und stationäre Phase. Die RP-HPLC-Säule besteht typischerweise aus funktionalisiertem Kieselgel mit gebundenen Alkylketten: C18 (Octadecyl, am universellsten für Peptide <5 kDa), C8 (Octyl, mäßig hydrophobe Peptide), C4 (Butyl, Peptide und kleine Proteine bis 20 kDa), C3/C1 oder Phenyl (selektive Retention von Aromaten). Typische Abmessungen sind 250 × 4.6 mm analytisch, 250 × 21.2 mm semipräparativ, 250 × 50 mm präparativ. Partikelgröße (3, 5 oder 10 μm) und Porosität (100-300 Å) beeinflussen Auflösung und Kapazität.
Mobile Phase und Gradient. Der Standardgradient kombiniert Wasser + 0.1% TFA (Lösungsmittel A, saure wässrige Phase) und Acetonitril + 0.1% TFA (Lösungsmittel B, organische Phase), wobei TFA als Ionenpaarreagenz wirkt, das die Ladungen des Peptids neutralisiert und die Peaksymmetrie verbessert. Ein typischer Gradient von 10 bis 70% B über 20-40 min ermöglicht die Trennung gängiger linearer Peptide. Die UV-Detektion bei 214 nm (Peptidbindung) und 280 nm (Tyr, Trp) ist universell; PDA-, ELSD- und MS-Detektoren (gekoppelte LC-MS) liefern zusätzliche Informationen.
Anwendungen bei Peptiden. Die analytische RP-HPLC validiert die Reinheit einer Charge (≥98% bei kommerziellen RUO-Peptiden), identifiziert Verunreinigungen (Deletion, Desamidierung, Oxidation, Racemisierung) und quantifiziert sie relativ. Die präparative RP-HPLC ist der entscheidende letzte Schritt der SPPS-Produktion, um das Zielpeptid von verkürzten Sequenzen, TFA-Addukt-Fragmenten und Syntheseverunreinigungen abzutrennen. Das Verfahren ist in den Monographien USP <621> und Ph. Eur. 2.2.46 für pharmazeutische Peptidprodukte beschrieben.
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