Escisión
La escisión designa la etapa final de la síntesis de péptidos en fase sólida: la liberación de la cadena peptídica completa de la resina de soporte y la eliminación simultánea de los grupos protectores de las cadenas laterales. Esta etapa, aparentemente sencilla, concentra varios retos químicos que condicionan la calidad y la pureza del péptido bruto obtenido antes de la purificación.
En química Fmoc, la escisión se realiza mediante tratamiento con un cóctel ácido a base de TFA (ácido trifluoroacético) concentrado, normalmente al 95% con un 5% de disolventes adicionales. Las cadenas laterales protegidas por grupos lábiles en medio ácido (tBu en Ser/Thr/Tyr, Trt en Cys/His/Asn/Gln, Boc en Lys, Pbf en Arg) se eliminan en paralelo con el mismo tratamiento ácido. El TFA protona el enlace entre el péptido y la resina (normalmente un éster o una amida bencílicos), lo que provoca su liberación en solución.
Los cócteles de escisión integran sistemáticamente "captadores": compuestos tiolados (EDT, mercaptoetanol) o aromáticos (anisol, tioanisol, TIS por triisopropilsilano), a veces con adición de agua. Su función es capturar los carbocationes generados por la salida de los grupos protectores, que de otro modo pueden alquilar las cadenas laterales nucleófilas (Trp, Met, Cys, Tyr) y generar impurezas difíciles de separar. La elección del cóctel depende de la composición en aminoácidos: el cóctel "Reagent K" (TFA/fenol/H2O/tioanisol/EDT) es el estándar para las secuencias ricas en Met/Trp/Cys; una mezcla más sencilla TFA/TIS/H2O basta para las secuencias menos sensibles.
El cóctel de escisión de la química Boc es radicalmente distinto: emplea HF gaseoso licuado a -5°C durante 1 a 2 horas, en presencia de captadores adaptados a la vía del ácido fuerte. La extrema toxicidad del HF y la corrosión que genera han ido excluyendo esta química de las producciones industriales modernas en favor de las condiciones Fmoc, más benignas, y reservan el HF a laboratorios especializados.
Tras la escisión, el péptido bruto en solución de TFA se precipita por adición de éter dietílico frío, se lava varias veces para eliminar los captadores y los subproductos, se seca y después se purifica por HPLC preparativa en fase inversa. El rendimiento tras la purificación depende de la calidad de la síntesis inicial y de la separabilidad cromatográfica de las impurezas. De ahí el valor de los análisis independientes: en lab-peptides-france.com, nuestros informes Janoshik publicados indican la pureza y el contenido realmente medidos.