Spaltung (Cleavage)

Die Spaltung (Cleavage) bezeichnet den letzten Schritt der Festphasen-Peptidsynthese: die Freisetzung der vollständigen Peptidkette vom Trägerharz und die gleichzeitige Entfernung der Seitenketten-Schutzgruppen. Dieser scheinbar einfache Schritt vereint mehrere chemische Herausforderungen, die die Qualität und Reinheit des vor der Reinigung erhaltenen Rohpeptids bestimmen.

In der Fmoc-Chemie erfolgt die Spaltung durch Behandlung mit einem Säurecocktail auf Basis von konzentriertem TFA (Trifluoressigsäure), typischerweise 95% mit 5% zusätzlichen Lösungsmitteln. Seitenketten, die durch säurelabile Gruppen geschützt sind (tBu an Ser/Thr/Tyr, Trt an Cys/His/Asn/Gln, Boc an Lys, Pbf an Arg), werden parallel durch dieselbe saure Behandlung entfernt. TFA protoniert die Verbindung zwischen Peptid und Harz (typischerweise ein Benzylester oder -amid), wodurch die Freisetzung in Lösung erfolgt.

Spaltungscocktails enthalten systematisch „Scavenger“: Thiolverbindungen (EDT, Mercaptoethanol) oder Aromaten (Anisol, Thioanisol, TIS für Triisopropylsilan), manchmal mit Wasserzusatz. Ihre Aufgabe ist es, die durch die Abspaltung der Schutzgruppen entstehenden Carbokationen abzufangen, die andernfalls nukleophile Seitenketten (Trp, Met, Cys, Tyr) alkylieren und schwer abtrennbare Verunreinigungen erzeugen könnten. Die Wahl des Cocktails hängt von der Aminosäurezusammensetzung ab: Der Cocktail „Reagent K“ (TFA/Phenol/H2O/Thioanisol/EDT) ist Standard für Met/Trp/Cys-reiche Sequenzen; eine einfachere Mischung aus TFA/TIS/H2O genügt für weniger empfindliche Sequenzen.

Der Spaltungscocktail der Boc-Chemie ist grundlegend anders: Er verwendet flüssiges, gasförmiges HF bei -5°C für 1 bis 2 Stunden, in Gegenwart von an den starken Säureweg angepassten Scavengern. Die extreme Toxizität von HF und die von ihm verursachte Korrosion haben diese Chemie schrittweise aus modernen industriellen Produktionen zugunsten der milderen Fmoc-Bedingungen verdrängt, sodass HF spezialisierten Laboren vorbehalten bleibt.

Nach der Spaltung wird das Rohpeptid in TFA-Lösung durch Zugabe von kaltem Diethylether ausgefällt, mehrfach gewaschen, um Scavenger und Nebenprodukte zu entfernen, getrocknet und anschließend durch präparative Umkehrphasen-HPLC gereinigt. Die Ausbeute nach der Reinigung hängt von der Qualität der ursprünglichen Synthese und der chromatographischen Trennbarkeit der Verunreinigungen ab. Daher der Wert unabhängiger Tests: Auf lab-peptides-france.com geben unsere veröffentlichten Janoshik-Berichte die tatsächlich gemessene Reinheit und den Gehalt an.