LC-MS (Cromatografía líquida-espectrometría de masas)
La LC-MS (Liquid Chromatography - Mass Spectrometry) es la combinación instrumental principal del análisis bioanalítico moderno. Asocia la separación cromatográfica líquida (HPLC o UHPLC) con la detección por espectrometría de masas, la mayoría de las veces mediante una fuente de ionización ESI. Se ha convertido en el método de elección para caracterizar y cuantificar péptidos y proteínas en mezclas complejas, en particular en farmacocinética, proteómica y control de calidad.
El principio del acoplamiento es una secuencia en tres etapas. La muestra se inyecta en una columna cromatográfica (generalmente de fase reversa C18 para péptidos, de 1 a 2 mm de diámetro, de 50 a 250 mm de longitud, partículas de 1.7 a 5 μm). Un gradiente de disolventes (agua + ácido fórmico al 0.1% a acetonitrilo + ácido fórmico al 0.1%) eluye los péptidos en orden creciente de hidrofobicidad. El flujo que sale de la columna pasa directamente a la fuente ESI, que lo ioniza, y los iones son analizados por el espectrómetro.
Las configuraciones instrumentales varían según el objetivo. Para la caracterización estructural y la proteómica bottom-up, se prefieren los analizadores de alta resolución (Orbitrap de 70k a 500k de resolución, QTOF de 30k a 60k) que miden la masa exacta con una precisión de ppm y fragmentan los precursores en MS/MS (adquisición dependiente o independiente de los datos, DDA/DIA). Para la cuantificación dirigida, un triple cuadrupolo en modo SRM/MRM alcanza una sensibilidad de pg/mL con una precisión del 5-10%, estándar en los estudios farmacocinéticos regulatorios.
Las aplicaciones peptidómicas abarcan la confirmación de la identidad de un péptido sintético (masa teórica frente a observada), el mapeo peptídico por digestión tríptica para validar la secuencia primaria de una proteína, el mapeo de las modificaciones postraduccionales (fosfopéptidos enriquecidos por IMAC, glicopéptidos por lectinas), la búsqueda de biomarcadores peptídicos en plasma u orina, y la caracterización de las impurezas de síntesis (péptidos truncados, racemizados, oxidados, desamidados).
En la cuantificación PK, la LC-MS/MS de triple cuadrupolo sigue siendo el patrón de referencia. Un péptido terapéutico se cuantifica en plasma tras la extracción (precipitación de proteínas, SPE), una separación de pocos minutos y la detección en una transición SRM específica (ion precursor m/z X → ion fragmento m/z Y). La adición de un estándar interno isotópico (²H, ¹³C o ¹⁵N) corrige las variaciones de matriz e ionización. El rango dinámico cubre típicamente de 3 a 4 órdenes de magnitud, con un límite de cuantificación de unos pocos pg/mL a ng/mL según la diana.
Puntos fuertes de la LC-MS: sensibilidad, selectividad, robustez frente a matrices complejas, cuantificación absoluta rigurosa. Limitaciones: coste del instrumento (varios cientos de miles de euros para un QTOF/Orbitrap reciente), experiencia técnica necesaria, mantenimiento exigente, optimización metodológica larga para cada péptido.