Inhibidor de proteasa
Un inhibidor de proteasa es un compuesto químico o biológico que bloquea la actividad enzimática de las proteasas, enzimas capaces de escindir enlaces peptídicos. En la investigación de péptidos, estos inhibidores desempeñan dos funciones clave: preservar la integridad de los péptidos estudiados frente a proteasas contaminantes o endógenas, y servir como objetos de investigación de vías biológicas específicas.
Existen varias clases según el mecanismo. (1) Inhibidores de serina proteasas: PMSF, aprotinina, leupeptina (dirigidos a tripsina, quimotripsina, plasmina, trombina). (2) Inhibidores de cisteína proteasas: E-64, yodoacetamida (dirigidos a papaína, caspasas, catepsinas). (3) Inhibidores de metaloproteasas: EDTA, EGTA, 1,10-fenantrolina (quelan Zn²⁺, Ca²⁺, bloquean las MMP, la ECA, la neprilisina). (4) Inhibidores de aspartil proteasas: pepstatina A (dirigida a pepsina, renina, BACE-1).
En el uso de laboratorio, los cócteles comerciales (Complete Protease Inhibitor, Halt) combinan de 4 a 7 inhibidores que cubren todo el espectro. Se añaden sistemáticamente a los lisados celulares, los homogeneizados de tejido y los tampones de purificación para evitar la proteólisis artefactual de los péptidos diana durante la extracción.
Para los propios péptidos de investigación en solución, la contaminación proteolítica suele ser insignificante en condiciones estériles, pero determinados protocolos in vitro (incubación con suero, cultivo celular) requieren la adición de inhibidores para medir una actividad «pura», independiente del recambio proteolítico.
Por último, ciertas moléculas del catálogo pueden actuar ellas mismas como inhibidores selectivos en contextos de investigación específicos (estudios de DPP-4, ECA, neprilisina, MMP), lo que abre vías experimentales variadas. Toda manipulación sigue siendo estrictamente RUO: estos inhibidores son herramientas de laboratorio, no sustancias para uso humano.
Los inhibidores de proteasas se clasifican según el mecanismo catalítico que bloquean: inhibidores de serina proteasas (PMSF irreversible, AEBSF más estable en solución, aprotinina reversible de amplio espectro, quimostatina), inhibidores de cisteína proteasas (E-64 dirigido a papaína y catepsinas, leupeptina de amplio espectro), inhibidores de metaloproteasas (EDTA quelante de Zn²⁺/Ca²⁺, 1,10-fenantrolina, fosforamidón), inhibidores de aspartil proteasas (pepstatina A dirigida a pepsina, renina, catepsina D).
En la investigación de péptidos RUO, estos inhibidores tienen varios usos: (1) preservar los péptidos en lisados celulares o muestras biológicas durante la cuantificación farmacocinética, (2) estabilizar las enzimas diana durante las pruebas de actividad in vitro, (3) estudiar vías metabólicas específicas bloqueando selectivamente una clase enzimática. Los cócteles comerciales (Roche cOmplete, Sigma P8340) combinan de 4 a 7 inhibidores para un amplio espectro. Algunos péptidos terapéuticos son en sí mismos inhibidores endógenos (por ejemplo, Ac-SDKP, inhibidor de la prolil oligopeptidasa, BPP-9a, inhibidor de la ECA en el origen del captopril). La medición de la inhibición se realiza mediante ensayo cinético de Michaelis-Menten (IC50, Ki, Km) con sustrato fluorogénico o cromogénico.