Endotoxina (LPS)
Una endotoxina es un componente tóxico de la membrana externa de las bacterias gramnegativas, formado principalmente por lipopolisacáridos (LPS). Liberadas durante la lisis bacteriana o la división celular, desencadenan una potente cascada inmunitaria en los huéspedes mamíferos (fiebre, choque séptico, activación de NF-κB, liberación de las citocinas TNF-α e IL-6). Su detección y cuantificación son críticas en la investigación con péptidos.
En un péptido de investigación RUO, la contaminación por endotoxinas procede típicamente de las materias primas, del agua de reconstitución o de una manipulación no estéril. El umbral aceptable depende del uso: los ensayos in vitro sensibles (macrófagos, células endoteliales, pruebas de inflamación) exigen < 1 EU/mg; los modelos animales, < 0.25 EU/mg; las aplicaciones farmacéuticas, < 0.5 EU/kg/hora.
El método de referencia es la prueba LAL (Limulus Amebocyte Lysate), basada en la coagulación de la sangre del cangrejo herradura en presencia de endotoxinas, con tres variantes: gel-clot (cualitativa), cromogénica (cuantitativa por absorbancia) y turbidimétrica. Los métodos recombinantes modernos (rFC, factor C recombinante) sustituyen progresivamente a la LAL por razones éticas y de reproducibilidad.
En la práctica, un COA de péptido serio incluye una medición de endotoxinas cuando el uso lo justifica. La ausencia de este dato en un péptido destinado a cultivo de células primarias o a pruebas de inmunología es una señal de alarma: incluso una contaminación baja puede sesgar por completo los resultados al inducir una respuesta inflamatoria parásita atribuida erróneamente al péptido estudiado. La prevención se basa en agua libre de endotoxinas, viales apirógenos y manipulación en campana estéril.
Las endotoxinas LPS se clasifican según su origen bacteriano (Escherichia coli, Salmonella, Pseudomonas) y la composición del lípido A, la parte biológicamente activa que se une al receptor TLR4/MD-2 de las células inmunitarias. La unidad estándar es la EU/mg (unidad de endotoxina por mg de péptido): 1 EU ≈ 0.1-0.2 ng del patrón de referencia de LPS (E. coli O111:B4 RSE). El límite de detección de los métodos LAL modernos alcanza 0.005 EU/mL.
En la práctica de fabricación de péptidos RUO, varias etapas críticas condicionan el nivel final de endotoxinas: (1) calidad apirógena de las materias primas y de las resinas SPPS, (2) agua ultrapura con endotoxinas < 0.25 EU/mL utilizada para la escisión, el lavado y la liofilización, (3) sala limpia ISO 7 u 8 según la etapa, (4) tratamiento final por ultrafiltración o cromatografía de afinidad con polimixina B para la despirogenación si es necesario, (5) envasado en viales de vidrio borosilicato de tipo I esterilizados por despirogenación térmica (250°C, 30 min como mínimo). Un certificado de análisis (COA) de grado investigación debe documentar el nivel de endotoxinas mediante la prueba LAL o un método recombinante rFC equivalente; lo que no figura en él no se ha medido.