Afinidad
La afinidad de un ligando (péptido, molécula pequeña, anticuerpo) por una diana biológica (receptor, enzima, ácido nucleico) designa la fuerza de la interacción no covalente reversible entre ambos componentes. Se cuantifica mediante la constante de disociación Kd, que corresponde a la concentración de ligando a la que el 50 % de los sitios de unión están ocupados en el equilibrio. Cuanto menor es la Kd, mayor es la afinidad.
Desde el punto de vista termodinámico, la afinidad resulta de un equilibrio entre la entalpía (ΔH, contribuciones de los puentes de hidrógeno, las interacciones electrostáticas y las fuerzas de van der Waals) y la entropía (ΔS, desolvatación de las superficies hidrófobas, cambios conformacionales del ligando y de la diana). Las Kd fisiológicas suelen ir de nanomolar (péptidos de señalización sobre sus receptores, anticuerpos de alta afinidad) a micromolar (iones, metabolitos sobre enzimas). Las afinidades picomolares caracterizan interacciones muy específicas (biotina-estreptavidina Kd ≈ 10⁻¹⁴ M, ciertos anticuerpos terapéuticos madurados).
Varios parámetros derivados precisan la relación ligando-diana. La Ki (constante de inhibición) mide la afinidad de un antagonista por una diana respecto a un ligando de referencia, mediante la ecuación de Cheng-Prusoff (Ki = IC50 / (1 + [L]/Kd)). La Bmax designa el número máximo de sitios de unión expresados por unidad de tejido o de célula y se obtiene mediante una curva de saturación. El número de Hill (nH) indica la cooperatividad: nH ≈ 1 para una interacción simple, > 1 para una cooperatividad positiva (unión del oxígeno a la hemoglobina, nH ≈ 2.8), < 1 para una cooperatividad negativa.
Los métodos experimentales para medir la afinidad son numerosos. La resonancia de plasmón superficial (SPR, Biacore) y la interferometría de biocapa (BLI, Octet) miden en tiempo real las constantes cinéticas de asociación (kon) y de disociación (koff), con Kd = koff/kon. La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) proporciona directamente Kd, ΔH, ΔS y la estequiometría n a partir de un único experimento. La anisotropía de fluorescencia (FP) es adecuada para péptidos marcados. Los ensayos de unión con radioligando (³H, ¹²⁵I) siguen siendo una referencia histórica para los receptores de membrana. En el cribado de alto rendimiento, los métodos de desplazamiento (FRET, TR-FRET, AlphaScreen) sustituyen a menudo a los radioligandos.
La interpretación farmacológica exige relacionar la afinidad con la actividad funcional. Un ligando de alta afinidad no es necesariamente un activador eficaz: un antagonista puede unirse a la Kd del agonista sin desencadenar la cascada intracelular. La EC50 (efecto funcional) difiere, por tanto, de la Kd (unión). En el desarrollo de péptidos, la optimización de la afinidad (SAR, modelado molecular, crio-EM) debe acompañarse de ensayos funcionales que confirmen el efecto biológico esperado. Los receptores con plasticidad conformacional (señalización sesgada de los GPCR) añaden otra dimensión: un mismo ligando puede activar de forma diferencial las vías de la proteína G frente a la β-arrestina según su firma de interacción.