NMR (Kernspinresonanz) ist ein spektroskopisches Verfahren, das auf der resonanten Absorption und Emission von Radiowellen durch Atomkerne in einem starken Magnetfeld beruht. Für Peptide ist sie die Referenzmethode zur Strukturaufklärung in Lösung, ergänzend zur Massenspektrometrie (Identität/Reinheit) und zur Röntgenkristallographie (Struktur im Festkörper).
Beobachtete Kerne. Die für die Peptidanalyse NMR-aktiven Kerne sind: 1H (Proton, Häufigkeit 99.98%, maximale Empfindlichkeit, direkte Beobachtung von Hα, HN, Seitenketten), 13C (Häufigkeit 1.1%, erfordert bei Peptiden >10 kDa eine Isotopenanreicherung, Information über Cα und Carbonylgruppen), 15N (Häufigkeit 0.37%, Anreicherung erforderlich, Information über die Amid-NH des Rückgrats), 19F (Sonde für fluorierte Peptide), 31P (phosphorylierte Peptide). Moderne Spektrometer arbeiten bei 400-950 MHz (Feldstärke 9.4-22.3 T), wobei die Auflösung mit der Feldstärke zunimmt.
1D- und 2D-Experimente. Die typische Peptid-NMR kombiniert: 1D 1H (Gesamtspektrum, 8-12 ppm Amide, 7-8 ppm Aromaten, 3-5 ppm Hα, 0-3 ppm Methylgruppen), 2D COSY/TOCSY (skalare Konnektivitäten, Zuordnung der Spinsysteme der Aminosäuren), 2D NOESY/ROESY (dipolare Konnektivitäten durch den Raum <5 Å, Randbedingungen für die 3D-Struktur), 2D HSQC/HMBC (1H-13C- oder 1H-15N-Korrelationen über 1 Bindung bzw. 2-3 Bindungen) und bei größeren Peptiden 3D-Experimente HNCA, HNCOCA, HNCACB, CBCACONH für die sequenzielle Zuordnung.
Anwendungen bei Peptiden. Die NMR ermöglicht: (1) die Strukturbestätigung durch Vergleich mit Referenzstandards, (2) die De-novo-sequenzielle Zuordnung, (3) die Bestimmung der 3D-Struktur in Lösung (NOE-Randbedingungen + Diederwinkel aus J-Kopplungen, Software XPLOR/CYANA/CNS), (4) die Charakterisierung zyklischer Peptide (Turn-Konformationen), (5) die Untersuchung von Dynamik und Konformationsaustausch (R1, R2, heteronuklearer NOE, Relaxationsdispersion). Alternative zu Cryo-EM und Röntgen, wenn eine Kristallisation nicht möglich ist. Siehe USP <761> für pharmazeutische NMR-Richtlinien.
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