HPLC-Reinheit
Die HPLC-Reinheit eines Peptids ist der zentrale Qualitätsindikator, den Lieferanten und Kontrolllabore verwenden. Sie entspricht dem prozentualen Anteil der Fläche des Hauptpeaks an der Summe der Flächen aller in einem HPLC-Chromatogramm bei einer gegebenen Wellenlänge detektierten Peaks. Es handelt sich um ein relatives, kein absolutes Maß: Es berücksichtigt weder Verunreinigungen, die bei der Analysenwellenlänge nicht absorbieren, noch Restsalze und Restlösungsmittel.
Das Berechnungsprinzip ist einfach: HPLC-Reinheit (%) = (Fläche des Hauptpeaks / Summe aller Peakflächen) × 100. Ein Peptid mit 98 % HPLC-Reinheit enthält also 98 % der Zielspezies und 2 % bei der Analysenwellenlänge detektierbare Verunreinigungen, verteilt auf einen oder mehrere Nebenpeaks.
Die Standardausstattung kombiniert eine C18-Umkehrphasen-Chromatographiesäule (typisch: 4.6 × 150 mm oder 2.1 × 100 mm, Partikel von 3 bis 5 μm), eine mobile Phase mit Acetonitril/Wasser-Gradient und 0.1 % Trifluoressigsäure (TFA) oder 0.1 % Ameisensäure sowie einen UV-Diodenarray-Detektor, der 220 nm (Amidbindung) und 280 nm (Tyrosin, Tryptophan) erfasst. Eine Flussrate von 0.5 bis 1 mL/min und eine Analysendauer von 10 bis 30 Minuten genügen, um die meisten Peptide zu trennen.
Die Akzeptanzschwellen hängen von der Verwendung ab. In der präklinischen In-vitro-Forschung akzeptiert die Konvention ≥ 95 % für die meisten Assays und ≥ 98 % für feine quantitative Assays (Bindung, Enzymologie, Pharmakokinetik). In der pharmazeutischen Entwicklung verlangen die Zulassungsbehörden ≥ 98 % mit erschöpfender Charakterisierung jeder Verunreinigung > 0.1 % (MS-Identifizierung, Herkunft, toxikologisches Profil). Die Arzneibücher USP und Ph. Eur. beschreiben die Kriterien je Monographie.
Die Interpretation eines HPLC-Chromatogramms umfasst mehrere Prüfungen. Erstens muss der Hauptpeak symmetrisch sein (Symmetriefaktor As zwischen 0.9 und 1.5); ein Tailing weist auf eine sekundäre Wechselwirkung mit der Säule oder auf Abbau hin. Zweitens muss die Auflösung zwischen dem Hauptpeak und benachbarten Verunreinigungen ausreichend sein (Rs > 1.5), um eine zuverlässige Integration zu ermöglichen. Drittens müssen die Nebenpeaks annotiert sein: Peaknummern, Retentionszeiten, relative Prozentanteile. Viertens muss die Basislinie stabil und ohne nennenswerte Drift sein.
Typische Verunreinigungen von SPPS-Peptiden erscheinen in folgender Reihenfolge: verkürzte Peptide (denen ein oder mehrere Reste fehlen, kürzere eluieren früher), Peptide mit oxidierten Aminosäuren (Met-Sulfoxid, polarer und daher früher eluierend), desamidierte Peptide (Asn→Asp + iso-Asp, oft zwei nahe beieinanderliegende Peaks), racemisierte Peptide (D-Isomer, mitunter unvollständige Koelution), Disulfid-Dimere. Eine sorgfältig durchgeführte HPLC-Analyse identifiziert jeden dieser Peaks durch gekoppelte MS für ein vollständiges Qualitätskontrolldossier.
Für Anwender von Forschungspeptiden ist die Forderung nach einem lesbaren HPLC-Chromatogramm (Hauptpeak, Retentionszeit, Prozentanteil), begleitet von einer die Identität bestätigenden Massenspektrometrie, das Minimum, um die Qualität einer Charge zu gewährleisten.