Die native chemische Ligation (NCL) ist eine grundlegende Methode der Peptidchemie, die 1994 von Philip Dawson und Stephen Kent eingeführt wurde (Science 266:776). Sie ermöglicht die Verknüpfung zweier Peptidfragmente über eine einzige native (unmodifizierte) Peptidbindung durch eine chemoselektive Reaktion unter milden wässrigen Bedingungen. Diese Innovation revolutionierte die chemische Synthese von Proteinen mit >50 Resten, die zuvor durch die direkte SPPS begrenzt war (exponentiell sinkende Ausbeute jenseits von 50 aa).
Chemisches Prinzip. Die NCL beruht auf der Reaktion zwischen einem Peptid mit C-terminalem Thioester (—COSR, hergestellt durch SPPS mit Dawson-/MeDbz-/Sulfonamid-Harz) und einem Peptid mit N-terminalem Cystein (—H2N-Cys-Peptid). Das Thiol des Cys greift den Carbonylkohlenstoff des Thioesters an und bildet ein transientes Thioester-Intermediat, das eine intramolekulare S→N-Umlagerung (5-exo-trig) durch Zyklisierung über das freie Amin des Cys durchläuft und so eine native Peptidbindung mit Cys an der Verknüpfungsstelle erzeugt. Die Reaktion wird in wässrigem Puffer bei pH 6.5-7.5 mit MPAA (4-Mercaptophenylessigsäure) als katalytischem Thiol, TCEP als Reduktionsmittel und 6M Guanidin als Denaturierungsmittel für unlösliche Peptide durchgeführt.
Erweiterungen und Varianten. Die Notwendigkeit eines Cys an der Verknüpfungsstelle wird durch verschiedene Erweiterungen umgangen: Desulfurierung nach der NCL (Cys → Ala, Yan & Dawson 2001), erweiterte Ligation mit Selenocystein (Sec, Hondal 2001), Thiol-Surrogate für Alanin/Valin/Leucin/Prolin (β-Thiol-Ala, γ-Thiol-Val, Payne & Chen), Expressed Protein Ligation (EPL, Muir 1998, biologischer Thioester über Intein), spurlose Staudinger-Ligation (Raines 2000) oder KAHA-Ligation (Bode).
Wichtige Anwendungen. Die NCL und ihre Erweiterungen haben die chemische Synthese von Insulin, Ribonuklease A, Histonen, Ubiquitin, β-Amyloid, HIV-Protease, Transthyretin und weiteren Proteinen bis ~300 aa ermöglicht. Sie erlaubt den ortsspezifischen Einbau von posttranslationalen Modifikationen (Phosphorylierung, Glykosylierung, Acetylierung, Methylierung, Ubiquitinierung), nicht natürlichen Aminosäuren, Fluoreszenzmarkern und Isotopenanaloga — was durch rekombinante Expression oder klassische lineare SPPS unmöglich ist.
