Amidierung
Die Amidierung ist eine posttranslationale Modifikation, die die freie Carboxylgruppe (-COOH) am C-terminalen Ende eines Peptids in eine Amidgruppe (-CONH₂) umwandelt. Bei Säugetieren wird diese Reaktion durch das bifunktionelle Enzym PAM (Peptidylglycin-Alpha-Amidierende Monooxygenase) katalysiert, das von Vitamin C und Kupfer abhängig ist und ein C-terminales Glycin als Stickstoffdonor in zwei Schritten nutzt (Hydroxylierung, dann Spaltung).
Diese scheinbar geringfügige Modifikation hat erhebliche biologische Konsequenzen. Sie neutralisiert die negative Ladung des Carboxylats, verändert die lokale Konformation, erhöht die Resistenz gegenüber Carboxypeptidasen und ist bei vielen Peptiden für die biologische Aktivität zwingend notwendig. Schätzungen zufolge sind etwa 50% der bioaktiven Hormonpeptide und Neuropeptide C-terminal amidiert.
Die Beispiele sind zahlreich und sinnbildlich: Oxytocin, Vasopressin, Substanz P, Neuropeptid Y, α-MSH, Gastrin, CCK, VIP, PACAP, Calcitonin, Amidorphin, CRH, GRP, Bombesin. Bei jedem von ihnen verliert die nicht-amidierte Form 90 bis 99% ihrer Affinität zum nativen Rezeptor.
Bei der SPPS-Peptidsynthese wird die Amidierung durch Verwendung eines Rink-Amid- oder MBHA-Harzes anstelle eines Harzes vom Wang-Typ erreicht: Bei der Abspaltung vom Harz am Ende der Synthese wird der C-Terminus direkt als Amid freigesetzt. Es handelt sich also um eine Harzwahl zu Beginn der Synthese, nicht um eine Modifikation am Ende.
Die korrekte Bestimmung des Amidierungszustands eines Peptids ist in der Forschung entscheidend: Ein als „amidiert“ ausgewiesenes Peptid muss eine theoretische Molekülmasse aufweisen, die im Vergleich zur freien Säureform um eine Einheit reduziert ist (der Ersatz von -OH durch -NH₂ verändert die Masse um -1 Da). Ein seriöses COA nennt explizit „C-terminales Amid“ oder „C-terminales -OH“, und die gemessene MS-Masse muss übereinstimmen. Die Verwechslung beider Formen kann ganze Versuchsreihen der vergleichenden Pharmakologie ungültig machen.
Die C-terminale Amidierung ist eine posttranslationale Modifikation, die durch das Enzym Peptidylglycin-α-Amidierende Monooxygenase (PAM) katalysiert wird, das nach oxidativer Spaltung einen C-terminalen Gly-Rest als Amiddonor nutzt. Etwa 50% der nativen Neuropeptide und Peptidhormone sind in vivo C-amidiert: Oxytocin, Vasopressin, GHRH, Calcitonin, Gastrin, Substanz P, NPY, Neurotensin. Diese Modifikation ist für die biologische Aktivität der meisten dieser Peptide essenziell: Die C-terminale Säureform von Oxytocin zum Beispiel ist an ihrem Rezeptor nahezu vollständig inaktiv.
Bei der SPPS wird die C-terminale Amidierung direkt durch die Harzwahl erreicht: Rink Amide MBHA oder Rink Amide AM für amidierte Peptide; Wang, 2-Chlortrityl, HMPB für Peptide mit freier Säure. Nach der TFA-Abspaltung setzt das Rink-Harz das C-amidierte Peptid mit einer Ausbeute > 95% frei. Die ESI-HRMS-Analyse unterscheidet leicht zwischen amidiertem und saurem Peptid: Differenz von -1 Da (monoisotopische Masse). In der Peptidpharmakologie ist die C-terminale Amidierung eine häufige Substitution zur Verbesserung der Halbwertszeit synthetischer Analoga (Ipamorelin, GHRP-2, GHRP-6 und Melanotan II sind C-amidiert). Universell ist sie nicht: PT-141, Semax und Selank enden auf eine freie Carbonsäure.